国产PCR仪ETC811与ETC811Plus主要性能测试

赫 晓 霞²  李 静 雯²  陈 尔 凝²  邹 明 强1  康 福 英²  张   捷3   罗艳非4  杜美红²*

(1. 中国检验检疫科学研究院，北京100123;2.北京市科学技术研究院分析测试研究所(北京市理化分析测试中心),北京 100094;3.中国海关科学技术研究中心，北京 100026;4.长春海关技术中心，吉林130031)

摘  要  为了解国产PCR仪ETC811与ETC811Plus主要性能，通过与同类国外仪器ABI9700和Eppendorf GSX1进行分组对标测试。使用红外线精密测温仪进行升温速率、降温速率、模块控温精度、温度准确度、模块温度均匀性、温度持续准确度的测试与分析，使用5000copy/PCR、500copy/PCR、50copy/PCR 温度敏感序列扩增实验进行生化性能  测试。结果显示，使用2年以上组ABI9700与ETC811、使用2年以下组 ETC811Plus与Eppendorf GSX1平均升温速率分别为2.40℃/s与2.30℃/s、2.50℃/s与2.60℃/s,平均降温速率分别为2.20℃/s与2.10℃/s、2.00℃/s与2.10℃/s,  模块控温精度分别为0.020℃与0.045℃、0.025℃与0.030℃,温度准确度的平均差值分别为-0.10℃与0.02℃、 0.17℃与0.11℃,模块温度均匀性的平均温度差值分别为0.53℃与0.48℃、0.46℃与0.31℃,温度持续准确度的相对偏差分别为相对偏差分别为5.3%与-0.8%、 -0.07%与-0.10%,生化性能扩增结果除使用2年以上组中ABI9700 为不可接受外，其他均为可接受。本研究测试的国产与进口PCR仪器各项温控指标均优于相关标准要求，且我国自主研发的ETC811与ETC811Plus具备与进口仪器等同甚至更优的性能。

关键词  国产仪器；PCR仪ETC811与ETC811Plus; 性能测试

聚合酶链反应 (Polymerase  chain  reaction,PCR)   是一种对特定 DNA 或 RNA 片段在体外进行快速、灵敏、特异扩增的方法[1]，温度和时间对于PCR 扩增效率至关重要。因此，基于 PCR 技术原理完成特异扩增的 PCR 仪器的温度控制性能是其核心功能。PCR 仪是生命科学研究中一种应用广泛、十分重要的关键仪器，主要应用于需要基因扩增和制造突变的各个领域中[2]。自从美国ABI公司率先开发第一台自动 PCR 仪以来，经过几十年的发展，国内外 PCR 仪技术日趋成熟，但由于昂贵的进口 PCR 仪起步早， 一直处于领先地位，导致国产PCR仪在我国基础科研中的普及率较低。

伴随我国科技水平的提升，国产高精密分析仪器与进口产品之间的差距越来越小[3,4]。目前来自国内十多家生产商的20多种国产普通PCR 仪器已取得医疗器械注册证[5]。国产自主研发的 ETC811 与 ETC811Plus PCR 仪器 ，ETC811 已获得欧盟 CE 认证与医疗器械注册证，ETC811Plus 已获得我国药监局二类医疗器械注册资质，国内用户数量5000多个， 具有独特且效果更优的温度均一性、防潮性能、静电导流、低噪音、故障自检和人性化操作界面等方面的 国家专利装置。因此，本研究选用与其同类进口仪器 ABI9700 和 EppendorfGSX1 进行对标，其中ETC811 与 ABI9700 为使用2年以上组， ETC811Plus 与 EppendorfGSX1 为使用2年以下组，依据 YY/T 1173- 2010 《聚合酶链反应分析仪》[1] 方法进行仪器温度控制性能测试实验，依据 SN/T 2102.2-2008/ISO/TS 20836:2005《食源性病原体 PCR 检测技术规范第 2 部分：PCR 仪性能试验要求》[6] 方法进行仪器生化检测性能测试实验，通过测试评价国产PCR 仪 ETC811 与 ETC811Plus 的温控性能与进口仪器之间的差异，以期为市场选用该类国产仪器提供理论依据。

1 方法

1.1 仪器设备

红外线精密测温仪(德国欧普士)。

1.2 试剂

TaKaRa MiniBEST  DNA  Fragment  Purification Kit，批号AJG1107A，  有效期2022.1。

1.3 温度控制性能测试

1.3.1 升温速率

分别在4台测试仪器中编辑一个在45℃恒温2min和95℃恒温2min之间循环的程序，将红外线温度传感器一端放入模块四角、四边中点和中心点测试孔，另一端连接数据采集仪，用数据采集仪记录仪器到达设定温度恒温10s后至恒温结束时间段内的温度变化。取50℃±0.5℃内一温度点TA，取90℃±0.5℃内一温度点TB，计算从TA到 TB的时间t的平均升温速率 V=(TB-TA)/t；扫描温度从50℃±0.5℃升至90℃±0.5℃过程中的瞬时最大温度变化△Tmax，计算最大升温速率V升max=△Tmax/△t(△t和△Tmax由测温仪给出 ) 。

1.3.2 降温速率

在上述测温数据中，取90℃±0.5℃内一温度点TA，取50℃±0.5℃内一温度点TB，计算从 TA 到 TB 的时间t的平均降温速率 V=(TB-TA)/t；扫描此过程中的瞬时最大温度变化△Tmax，计算最大降温速率V降max=△Tmax/△t(△t和△Tmax由测温仪给出)。

1.3.3 模块控温精度

在55℃±5℃、72℃±5℃、95℃±5℃各取一温度点，设置恒温2min,  循环次数为5的程序。将温度传感器一端放入模块四角、四边中点和中心点测试孔，另一端连接数据采集仪，用数据采集仪记录仪器到达设定温度恒温10s后，计时30s, 记录最高温度和最低温度，二者差值一半为△Ti(i=1,2,3,4,5),连续记录5个循环。使用 SPSS19.0 软件对△Ti值进行统计学差异分析。

1.3.4 温度准确度

在55℃±5℃、72℃±5℃、95℃±5℃各取一温度点，设置恒温2min 的程序。将温度传感器一端放入模块四角、四边中点和中心点测试孔，另一端连接数据采集仪，用数据采集仪记录仪器到达设定温度恒 温10s 后，计时60s, 每10s记录温度Ti(i=1,2,3,4,5,6)，取Ti平均值Tm, 计算Tm均值与设定温度差值△T。 使用SPSS19.0 软件对Ti 值进行统计学差异分析。

1.3.5 模块温度均匀性

在55℃±5℃、72℃±5℃、95℃±5℃各取一温度点，设置恒温2min,  循环次数为5的程序。将温度传感器一端放入模块四角、四边中点和中心点测试孔，另一端连接数据采集仪，用数据采集仪记录仪器到达设定温度恒温10s后，计时60s, 记录温度Ti(i =1,2,3,4,5,6),取 Ti最大值与最小值，计算各孔位温度差值△T。使用 SPSS19.0 软件对 Ti 值进行统计学差异分析。

1.3.6 温度持续准确度

编辑一个在45℃恒温60s和95℃恒温60s之间循环的程序，将温度传感器一端放入模块测试孔另一端连接数据采集仪，以95℃±0.5℃为计时参考点，自显示温度首次到达计时参考点开始计时，至末次到达计时参考点结束，记录时间Ti(i=1,2,3,4,5), 连 续记录5个循环，取5个循环记录时间的平均值Tm, 计算相对偏差 (Tm-60)/60*100%。使用SPSS19.0 软件对Ti 值进行统计学差异分析。

1.4 生化检测性能测试

在 AB19700 、ETC811 、ETC811Plus 、Eppendorf GSX1上对362bp 温度敏感序列模板进行扩增并纯化后，用Qubit 法测定DNA 目的片段浓度，计算并制备5000copy/PCR、500copy/PCR、50copy/PCR 的序列模板，各浓度模板扩增做5个反应体系(分别命名 为 a1-a5,b1-b5,c1-c5)，分别置于仪器反应板的四角与中心位置，在ABI9700、ETC811、ETC811Plus、EppendorfGSX1 四台仪器同时进行扩增。

2 结果

2.1 升温速率

使用2年以上组ABI9700 与 ETC811、使用2年以下组ETC811Plus与 EppendorfGSX1平均升温速率 分别为2.40℃/s 与2.30℃/s 、2.50℃/s 与2.60℃/s,V升max分别为3.60℃/s 与3.40℃/s 、3.60℃/s与3.60℃/s。 即：使用2年以上组国产仪器 ETC811 的升温速率略低，而使用2年以下组国产 ETC811Plus 与进口仪器 完全一致。

2.2 降温速率

使用2年以上组ABI9700与ETC811、使用2年以下组ETC811Plus与 Eppendorf GSX1平均降温速率分别为2.20℃/s 与2.10℃/s、2.00℃/s 与2.10℃/s,V降max分别为3.10℃/s与2.70℃/s、2.50℃/s 与2.60℃/s。 即：使用2年以上组国产仪器 ETC811 的降温速率略低，而使用2年以下组国产 ETC811Plus 与进口仪器一致。

2.3 模块控温精度

使用2年以上组ABI9700与ETC811、使用2年以下组ETC811Plus与 Eppendorf GSX1最大△Ti分别为0.020℃与0.045℃、0.025℃与0.030℃,均< 0.05℃。即：使用2年以上组国产仪器 ETC811的模块控温精度显著低于进口仪器 (P=0.001)，而使用2年以下组国产仪器 ETC811Plus与进口仪器的△Ti值无差异 (P=0.43)。

2.4 温度准确度

使用2年以上组ABI9700与ETC811 、使用2年以下组 ETC811Plus 与 Eppendorf GSX1均值Tm与设定温度差值分别为-0.03℃与-0.11℃、0.01℃与 0.12℃;在72℃±5℃的均值Tm与设定温度差值分别为0.015℃与0.08℃、0.21℃与0.18℃;在95℃±5℃的均值Tm与设定温度差值分别为-0.29℃与0.08℃、0.29℃与0.04℃,Tm与设定温度差值的平均值分别为-0.10℃与0.02℃、0.17℃与0.11℃,绝对值均<0.3℃。 即：使用2年以上组国产仪器 ETC811的温度准确度显著优于进口仪器 (P=0.013)，而使用2年以下组国产仪器ETC811Plus 与进口仪器间无差异 (P=0.884)。

2.5 模块温度均匀性

使用2年以上组ABI9700 与 ETC811、 使用2年以下组ETC811Plus 与 Eppendorf GSX1在55℃±5℃ 的各孔位温度差值△T分别为0.48℃与0.39℃、0.44℃ 与0.24℃,在72℃±5℃的各孔位温度差值△T 分别为0.57℃与0.52℃、0.42℃与0.30℃,在95℃±5℃ 的各孔位温度差值△T分别为0.55℃与0.53℃、0.52℃ 与0.38℃,△T 均值分别为0.53℃与0.48℃、0.46℃ 与0.31℃,均≤0.55℃。即：使用2年以上组国产仪器 ETC811的模块温度均匀性显著低于进口仪器  (P=0.000),而使用2年以下组国产仪器 ETC811Plus 与进口仪器间无差异 (P=0.881)。

2.6 温度持续准确度

使用2年以上组ABI9700 与 ETC811、使用2年 以下组 ETC811Plus 与 Eppendorf GSX1 在60.00℃连 续记录5个循环时间平均值Tm温度分别为63.20℃与 59.50℃、59.96℃与59.94℃,相对偏差分别为5.3% 与-0.8%、 -0.07%与-0.10%。即：使用2 年以上组国产仪器ETC811的温度持续准确度显著优于进口仪器 (P=0.000),而使用2年以下组国产仪器 ETC811Plus 与进口仪器间无差异 (P=0.905)。

2.7 生化性能

使用2年以上组ABI9700与ETC811、使用2年以下组ETC811Plus与 Eppendorf GSX1均成功扩增出 362bp 目的片段产物；对5000copy/PCR、500copy/ PCR、50copy/PCR  温度敏感序列模板的扩增结果显 示，使用2 年以上组国产仪器ETC811未扩增出 50copy/PCR,  结果为可接受，而进口仪器仅能扩增出 5000copy/PCR 模板，结果为不可接受；而使用2年以下组国产仪器ETC811Plus与进口仪器均可成功扩增出，结果均为可接受。即：使用2年以上组国产仪器 ETC811的生化性能优于进口仪器，使用2年以下组国产仪器 ETC811Plus与进口仪器性能一致。

3 结 论

PCR 仪作为一项关键和常规的分子生物学技术设备，被广泛应用于微生物、食品、医学及动植物等领域中，是十分重要的生命科学仪器。温控性能作为PCR 仪主要分析性能，其稳定性、准确性及均匀性都会直接影响PCR设备测试结果。国产PCR仪ETC811系列在温度均一性上具有自主研发的“环形非均匀辅助加热系统”国家专利，其温控性能是能够与国外知名品牌相媲美的少数国产品牌。因此，本研究依据行业标准 YY/T1173-2010 与 SN/T 2102.2-2008/ISO/TS 20836:2005 设置并完成了国产PCR仪器ETC811与 ETC811Plus的升降温速率、模块控温精度、温度准确度、模块温度均匀性、温度持续准确度以及最终通过温度敏感序列扩增的生化性能等多个核心性能指标测试，通过同类进口仪器 AB19700与 Eppendorf GSX1的分组对标测试，并使用2年以上组与使用2年以下组的分组比较，对国产PCR仪器ETC811与ETC811Plus的核心性能进行了系统测试。结果显示， 国产与进口仪器的各项温控指标均优于相关标准要求，且当下我国自主研发的PCR仪器ETC811与ETC811Plus已具备与进口仪器等同甚至更优的性能。

表1 测试实验结果汇总